DNA是生命的密碼，上次介紹過很厲害的次世代定序，幫助我們破解這個密碼。但如果我們想再進一步，想改變這個密碼，從而改變生命呢？今次史丹福想介紹一個幫助我們改變基因，從而改變生命的突破性新技術──CRISPR-Cas9技術。
CRISPR-Cas9是一個可以隨意切斷任何指定的DNA位置，從而刪除或者改變某個特定基因。其實在CRISPR/Cas9出現之前，科學家都有幾個方法可以做到這個工作，如ZFN（Zinc Finger Nuclease）及TALEN（Transcription Activator-Like Effector
Nuclease），但這些蛋白質都不容易製作，科學家往往要費九牛二虎之力才能編輯一個基因，而且它出錯的機會也很高。這些困難要等到 CRISPR – Cas9技術出現才得以解決。
故事發生在1990年代初，地中海的一個美麗港口──聖波拉。博士後研究生Francisco Mojica在這個港口城市長大，所以他的研究也是跟這個海港有關的Haloferax mediterranei──一種在聖波拉沼澤中分離出來，可以在極高鹽分環境下生長的細菌。他在這種細菌的DNA中找到一個很有趣的結構。這些約30bp的DNA片段前後對稱，也就是正著念和反著念都相同。它們不斷重複，而且中間隔著約36bp的間隔DNA。簡單來說，你可以想像這個結構像是一條串燒，這條串燒由很多腸仔組成，但腸仔中間是不同的其他食物，可以是菠蘿，可以是魚蛋，可以是燒賣…，所以結構就是「腸仔－菠蘿－腸仔－魚蛋－腸仔－燒賣－腸仔…」。「腸仔」就那個約30bp，前後對稱的DNA片段；而其他食物就是中間隔著的間隔DNA。
Francisco Mojica後來發現石野良純帶領團隊已經在大腸桿菌的DNA中發現了類似的結構，但這個日本的團隊似乎未領會到它的重要性，Francisco
Mojica卻堅信這個特別的DNA結構一定是非常重要的。他之後繼續他的研究，他在多種細菌中都發現了類似的結構，並把這個結構命名為常間回文重複序列叢集（clustered regularly interspaced short palindromic repeats），簡稱CRISPR。但這個結構有甚麼用呢？有科學家提出過DNA修復、基因調控等假設，但都找不到證據支持。結果問題還是由Francisco Mojica自己解決，他首先提出了證據，顯示CRISPR是細菌的後天免疫系統。這真是個新奇的發現，人們從來都沒有意識過細菌是有後天免疫系統的。
之後，很多科學家都投入了CRISPR的研究，他們發現原來CRISPR中間的序列是其他病毒的基因。他們也發現了幾個與CRISPR相關的基因，叫做CAS（CRISPR associated proteins）。當病毒入侵細菌時，會把自己的基因注入細菌中，而細菌為了防禦，它的CAS基因會轉譯出CAS蛋白，CAS會把病毒基因消化，然後把病毒基因放在CRISPR基因中間，令病毒基因變成「串燒」的一部分。
當相同的病毒再入侵細菌時，細菌已經「記得」這個基因。間隔DNA會轉錄出CRISPR RNA，簡稱crRNA。其中一種CAS蛋白Cas9會與crRNA結合，Cas9蛋白靠crRNA認出入侵的病毒基因，把基因的雙鏈DNA分開並切斷，毀滅了這個DNA，防止了病毒感染。
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CRISPR如何幫助細菌對抗病毒入侵 （來源：Science in the News (Harvard University)）
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你們可能會覺得，這個故事到目前為止都只是一個研究細菌基因的基礎研究，為什麼可以發展成為一套改變生命密碼的革命性技術？其實很多時候，突破性的科學應用技術都是來自基礎的科學研究，而且基礎科學家最初作研究的時候，根本就不會知道這些知識在未來會有如此意想不到的應用價值。
Francisco Mojica最初研究CRISPR，純純是出於到細菌特殊基因結構的好奇，之後的發展是他完全是他意料之外的。所以當下次有人問你基礎科學研究有甚麼用的時候，你可以用這個故事為例子，並且告訴他：No knowledge is useless。世界上並沒有無用的知識，只有認識得不夠深入，不知道怎樣去用的人。
好，讓我們繼續一起看看故事的發展。Emmanuelle Charpentier是一位法國的微生物學家，她對找出一種常見細菌Streptococcus pyogenes的調節性RNA（對調節性RNA有興趣的朋友可以參考史丹福的舊文章）很有興趣，她在CRISP基因位置附近找到了幾個有潛質的RNA，但她沒有方法再進一步去得知這些RNA的特性，直到她在一個科學會議上遇上了另一位德國微生物學家Jorg Vogel。Jorg Vogel提議用新的次世代定序技術（對次世代定序有興趣的朋友可以參考史丹福的舊文章）去研究這個問題。他們最後發現了一個協助CRISPR系統的RNA──tracer RNA。Tracer RNA會處理crRNA，然後與CAS9一起合作抵擋病毒的入侵。
之後Emmanuelle Charpentier在2011年遇到改變她一生的拍擋──加州大學柏克萊分校（University of
California, Berkeley）的RNA專家Jennifer Doudna 。她們決定一起合作去繼續鑽研CRISPR-Cas9。她們有一個新想法，就是把crRNA與tracer RNA連在一起，製造一個單一的RNA，她們稱這一個單一RNA為single-guided RNA，簡稱sgRNA。而且她們發現只要她們把想要被目標DNA序列加進這個sgRNA中，sgRNA就可以引導Cas9去切割這個目標。這個方法大幅度地簡化了CRISPR-Cas9系統，令世界各地的科學家可以輕易地切割任何目標DNA序列。
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a. 細菌利用crRNA與tracer RNA去引導Cas9切割拍定的DNA序列
b. Emmanuelle Charpentier與Jennifer Doudna把crRNA與tracer RNA連在一起，製造出single-guided RNA
（來源：Sander JD, Joung JK. CRISPR-Cas
systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature
Biotechnology 2014:32,347-355.）
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當DNA被切割後，就可以由兩個不同的方法去修復，第一個叫non-homologous end joining（NHEJ），這個方法會為被切割帶來一個缺失（deletion）或插入（insertion），後果就是把這個基因的功能刪去。第二個方法叫做homology directed repair（NDR），這個方法甚至可以把一段新基因加進被我們切割的位置。
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| 被切斷的DNA進行修復 （來源：Science in the News (Harvard University)） |
與其聽史丹福的介紹，不如讓CRISPR-Cas9技術的始創人Jennifer Doudna親自為大家講解：
2013 年美國麻省理工學院的華裔生物學家張鋒將CRISPR-Cas9系統用於哺乳動物多個基因（multiplex）的編修，並獲得成功。他是CRISPR-Cas9技術的集大成者。因為以往ZFN和TALEN等基因編輯技術只可以修改一個基因，但高等生物有很多的疾病或者生物特徵都是由多個基因控制的。要一次過修改多個基因，只有CRISPR-Cas9技術能做到。
但令人意想不到的是，CRISPR-Cas9技術的成功卻挑起了科學家團隊之間的不和，最後引起了一場專利訴訟。事緣Emmanuelle Charpentier及Jennifer
Doudna 比張鋒早了 7 個月申請 CRISPR 專利，但美國專利商標局卻把第一個 CRISPR 的專利發給張鋒，這項專利涵蓋了所有用CRISPR-Cas9技術作的真核細胞（Eukaryotic cells）基因修改。Emmanuelle
Charpentier及Jennifer Doudna 認為雖然張鋒是第一個用CRISPR-Cas9技術去修改高等生物基因的人，但張鋒的研究卻是基於她們研究的結果，所以專利理應給她們。但張鋒卻交出了 2012 年初的實驗室筆記證明他在Jennifer Doudna的發現前已經早有利用CRISPR-Cas9技術修改高等生物基因的想法。
經過多年的訴訟，美國專利局法庭終於在今年（2017年）2月15日宣佈，Jennifer Doudna針對張鋒的真核細胞CRISPR-Cas9基因編輯技術的專利幹擾訴求不成立。美國專利局法庭的判決稱Jennifer Doudna團隊的專利申請只是在試管中剪切DNA片段，沒有涉及細胞、基因組及基因編輯，而且她們的研究只是對自然現象的研究，不是一個新發明，所以並不能申請專利。
但不管如何，CRISPR-Cas9技術已經為科學界帶來重大的改變。它的應用包括研究基因的功能、藥物研究、改量農作物、控制害蟲，甚至是人類的基因治療。
CRISPR-Cas9技術是諾貝爾獎的超級大熱門，它在生理學及醫學獎的熱門程度差不多就等如重力波在物理學獎的熱門程度。科學界一般相信，這項技術獲獎只是時間的問題，而獲獎最大的障礙，似乎就是科學家之間的不和。
資料來源：
1. Lander E. The Heroes of CRISPR. Cell
2016:164,18-28.
2. Sander JD, Joung JK. CRISPR-Cas systems
for editing, regulating and targeting genomes. Nature Biotechnology 2014:32,347-355.
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