諾貝爾獎前奏：RNA的新世界

本年度的諾貝爾獎尚有一個星期（10月3日）就要正式公布了。史丹福作為一位科學愛好者，打算藉此機會，一連幾篇文章跟大家介紹一下幾個得獎的大熱領域，好讓大家可以稍為認識一下各個科學領域的最新發展及突破。

今次先跟大家談談RNA的發展。科學界一直以來覺得生物學的世界就是DNA的世界。只有破解到DNA的秘密，就可以掌握到生命的秘密。RNA一直都只是一位隱藏在DNA的光芒下的配角。直到兩個大發現，令科學界開始對RNA刮目相看。一是RNA原來有催化的作用，它可以在不需要蛋白質的情況下自我催化，這個發現粉碎了科學界一直以來覺得只有蛋白質才有催化活性這個根深柢固的概念。

第二個突破來自發現一群具有調控功能的全新RNA，其中包括microRNA（簡稱miRNA）及small interfering RNA（簡稱siRNA）。根據生物學的「中央發則」（Central dogma），基因的資訊一定是依著DNAàRNAà蛋白質的方向傳遞，而蛋白質就可以透過不同的方法影響細胞活動。所以DNA就像是一個電視台，是資訊的來源；蛋白質就像是電視機，負責執行那些來自電視台的資訊；至於RNA，則是無線電波，負責把電視台的資訊帶到電視機。

假如DNA出錯，就像是一間電視台出現問題，不斷播放低質素、是是旦旦的維穩電視節目。那要甚麼方法解決呢？方法一就是把那個垃圾電視台（DNA）關掉，或引入其他質素高的電視台。無奈基於一籃子因素，這是難以達成的。方法二是關掉電視機（蛋白質），這也未嘗不是一個好方法。事實上，現時有不少的傳統藥物，都是在蛋白質的層面影響細胞活動的。但其實還有一個新穎的方法，就是干擾為電視台傳播訊息的電波（RNA）。隨著大家對RNA這個「電波」的認識越來越深，我們發現原來電波不但可以用來傳遞訊息，更可以干擾其他電波。也就是說，RNA可以干擾RNA，從而改變生物的特性。

我們的DNA中大約有50%會被轉錄成RNA，在這些RNA中，只有2%是會被轉譯成蛋白質的mRNA，另外約98%的RNA是不會轉譯成蛋白質的non-coding RNA（簡稱ncRNA）。但non-coding不等如它是沒有用的垃圾，它們也有非常重要的生物學功能，如較為大眾熟悉的tRNA及rRNA就是轉譯蛋白質時不可或缺的生物分子。另外兩種較新發現的ncRNA，就是之前提及的miRNA及siRNA。

這般生物學的浪潮起緣於1993年。當時Victor Ambros的團隊（包括兩位主將Rosalind Lee、Rhonda Feinbaum）對一組於位線蟲內的lin-4基因產生了興趣，因為lin-4的突變會令變成畸形。經過一段時間的努力，他們發現lin-4的產物可以抑制另一組名為lin-14的基因。當時該團隊既然lin-4的產物有抑制基因的作用，那它理應是種蛋白質吧。但當他們再進一步深入研究時，發現這產物竟然是一種史無前例的，只有22nt大的超級迷你RNA（在此之前發現的RNA都是起碼幾百nt大的）。這種超級迷你RNA於是就被命名為microRNA。Victor Ambros的拍擋Gary Ruvkun之後比較了lin-4與兩個基因序列，他發現這兩個序列有很大部分是互補的，與lin-14 mRNA互補的lin-4 miRNA黏在lin-14 mRNA上，直接影響mRNA的轉譯（這是大家對miRNA機制的最初認識，他們後來知道原來還有另一個機制，牽涉到RNA interference，之後會再作介紹。）。當初Victor Ambros的團隊只是想研究一條有趣的基因，誰不知卻無心插柳地帶起了一輪生物學的革命。

由於這種具有調節功能的超級迷你RNA實在太令人匪夷所思，科學家們最初相信它只是一種在線蟲中獨有奇特分子。直到2000年，Gary Ruvkun再發現另一種名叫let-7的miRNA，而這種分子在高等的哺乳類動物都存在，自始miRNA的發現如雨後春筍，至今科學家已在人類的基因中找到超過700種miRNA。

在討論miRNA的結構及調控原理前，讓我們先看看另一個科學大發硫。1990年，科學家有一個無心插柳的發現。他們原本想在一種開紫花的植物中加入紫色色素的基因，令它們開的花會更紫。但結果出付他們意料之外，花瓣上反而出現了一塊塊白色區域，原來原有的紫色色素基因及新加入的紫色色素基因同時被關閉了！當時，他們並不知道為什麼會發生如此奇怪的事，只是留意到紫色色素基因mRNA含量明顯減少，這現象被稱為「轉錄後基因沉默化」（Post-transcriptional gene silencing）。

奇怪的事情陸續發生，今次出現在線蟲上。科學家本想研究方法關掉線蟲的基因，他們為線蟲注射了與該基因反義（antisense）（我們知道RNA中，A與U是對應的，G與C是對應的，只有對應的base才可以黏在一起，反義的意思就是與基因完全相對應，）的RNA，它與該基因的mRNA互補，所以會黏在mRNA上，阻止它與外界接觸，遮掩mRNA上的訊息，自然就不能把訊息傳到蛋白質中。正如他們所預料，他們成功了，反義RNA可以關閉基因。但令他們驚訝的是，就算他們把正義（sense）的mRNA注射到線蟲，那個基因一樣會被關閉。

之後，在1998年Andrew Fire及Craig Mello把這些奇怪的現象推到一個新高峰，他們把正義和反義的RNA黏起來，變成雙股RNA，之後把它們注射到線蟲中，他們發現雙股RNA關閉基因的能力竟然比正義及反義的RNA都高了近十倍！這個現象被稱為「核糖核酸干擾」（RNA interference）。原來植物的Post-transcriptional gene silencing也會發生在動物中，令mRNA含量減少。

究竟雙股RNA進入生物體內之後發生甚麼事？為什麼可以把基因關掉？

David Baulcombe及Andrew Hamilton之後繼續研究這些現象，他們發現植物的post-transcriptional gene silencing（其實與RNA interference是同一個現象，只不過一者在動物，一者在植物）原來是由一種只有25nt的超級微小雙股RNA由起的。這種小RNA不同於我們之前提及的microRNA，David Baulcombe團隊把它們稱為small interfering RNA（siRNA）。

原來當雙股RNA被送進細胞後，就會發生以下的事情：
1.DICER（一種RNA酶）會把雙股RNA切成多個小段，成為更小的雙股RNA，即是siRNA
2. siRNA 與一種叫AGO的蛋白質合體，變成一種名叫RNA-induced silencing complex（RISC）的分子， siRNA 的雙股結構會去掉其中一股，只剩下反義的一股
3. 這個RISC是一隻超級「mRNA殲滅者」，siRNA反義的部分就是它的探測器，與目標mRNA相對應互補，會跟目標mRNA黏在一起，這隻「殲滅者」就是這樣尋找它的獵物
4. 當黏在一起之後，RISC就會把mRNA切斷，令它們無法再轉譯出蛋白質

之前提及的miRNA，原來都是用類似的原理去干擾mRNA。miRNA從一些基因的非編碼片段轉錄而來，轉錄出來最原始的產物被稱為pri-miRNA。Pri-miRNA上面還有一些可以互補的序列，這些序列就與雙股RNA一樣，互相配對，黏在一起，令pri-miRNA上有多個像髮夾般的構造。之後，一種稱為DROSHA的RNA酶會把pri-miRNA上的「髮夾」切開，最後DICER就會把雙股的pri-miRNA切開，製成成熟的miRNA。miRNA再裝嵌成RISC這隻「mRNA殲滅者」，把mRNA切斷。miRNA就是用這個方法關掉基因。

之前我們把DNA比喻為電視台，mRNA比喻為電視台發出的電波，而miRNA及siRNA就是可以干擾電波的工具，它們不需要影響DNA，只要把mRNA殲滅掉，自然就能切斷訊息，關掉基因。而miRNA及siRNA的分別在於，miRNA是生物從自己的基因轉錄出來的，是生物自己用來調控基因的工具；siRNA則是從外來的雙股RNA中合成的，可以是人類在實驗室中製造出來關掉基因的工具，也可以是自然界中一種物種用來攻擊另一物種的武器。

這些新型的調控RNA已經為生物學帶來翻天覆地的轉變。如miRNA被發現是人類自身調控癌症及心血管疾病基因的工具，所以我們可以透過檢查這些miRNA去預測病人的病情及對治療的反應。而siRNA就是生物用來對抗病毒入侵的利器。另外，正如之前所講siRNA也為我們提供了一個隨意人工地關閉基因的方法，這對實驗研究很有幫助，將來甚至可能可以用於基因治療。

由於RNA interference對科學界的影響實在太大，發現這現象的Andrew Fire及Craig Mello在這發現的短短幾年後（2006年）已經得到諾貝爾生理及醫學獎。但科學界普遍覺得諾貝爾委員會遺留了很多對這領域有重要貢獻的科學家，如發現miRNA的Victor Ambrose，發現miRNA機制的Gary Ruvkun，及研究植物post-transcriptional gene silencing並發現siRNA的David Baulcombe。他們已經得到過Wolf Prize及Lasker Award等僅次於諾貝爾獎的科學界大獎。他們有沒有機會再下一城，得到諾貝爾獎？我們拭目以待。

資料來源：

1. Morris KV, Mattick JS. The rise of regulatory RNA. Nat Rev Genet 2014:15,423-37.

2. Lee R, Feinbaum R, Ambros V. A short history of a short RNA. Cell 2004:116(2 Suppl):S89-92.

中秋切月餅

中秋節大家都愛吃月餅，但切月餅要切得好也不容易的。趁著中秋佳節，問大家一個關於切月餅的問題：假如我有一個三尖八角、形狀奇怪的月餅，我在月餅上胡亂加一個紅點，現在限定你只能切一條直線，而且那條直線一定要通過那紅點，問是否必定有方法把月餅公平地分為面積相等的兩份？

假設下圖就是我們的月餅：

好，我們先胡亂地畫一條穿個紅點的線，並把那條線分開的兩個部分稱為1及2，它們的面積分別是A1及A2，設那條線與水平線間的角度是θ。設f(θ) = A1(θ)- A2(θ)，我們的目標是令到A1及A2相等，所以f(θ) = 0。

設一開始的時候θ = θ1。如果f(θ1) = 0，那月餅已經被平均分成兩份，問題解決。

如果f(θ1)不是0，我們慢慢把線沿著紅點逆時針地轉，令θ越來越大，直到轉了180°。

f(θ1 + 180°) = A1(θ1 + 180°) - A2(θ1 + 180°) = A2(θ1) - A1(θ1) = - f(θ1)

f(θ)是一個continuous function。f(θ1 + 180°) = - f(θ1)， f(θ1)及f(θ1 + 180°)一正一負。所以f(θ) = 0在θ1 < θ < θ1 + 180°中一定有至少一個根。也就是說，我們慢慢把線沿著紅點逆時針地轉的時候，一定有一點可以令到兩個部分面積相等。

我們用一點點高中數學就已經輕易地證明到月餅一定可以衼公平地分為面積相等的兩份。至於如何才做得到呢？大家慢慢想想吧。

病理筆記：再來2個血液學的個案2

抱歉，小弟近來疏於寫作，把這篇文章拖得太久了。以下是上次跟大家分享的幾個個案（http://drstanford.blogspot.hk/2016/08/3.html）的診斷結果。

個案1：

這幾張顯微鏡片有大量的不成熟細胞，它們比正常白血球大顆，細胞核佔了細則很多的位置，而且很「鬆」，又「三尖八角」，兼沒有甚麼顆粒（granules）。我們稱這種細胞為blast cells（母細胞）。

這種不成熟的白血球可厲害了，它是所有血液細胞之母，基本上所有的血液細胞，由白血球到紅血球到血小板，都是從它身上演變出來的。血液母細胞大致上分為兩種，分別為myeloblast及lymphoblast。Lymphoblast可以演化成淋巴細胞，而myeloblast可以演化成除淋巴細胞外的其他血液細胞。如果病人的血液細胞生長異常，這種不成熟的細胞就會增多。情況就好像假如這世界的生育率突然急增很多很多倍，那街道上自然充斥著不成熟的小孩。

再看看病人的骨髓，同樣有大量的blast cells。

如果病人血液中或者骨髓中的blast cells高於20%，那他得的就是急性白血病。急性白血病分為兩大類──急性骨髓性白血病（Acute myeloid leukemia，AML）及急性淋巴性白血病（Acute lymphoblastic leukemia，ALL）。AML是myeloblast多於20%，ALL是lymphoblast多於20%。

至於如何在顯微鏡下分辦myeloblast及lymphoblast？這可不簡單了，因為它們都太不成熟，形狀都很相近。情況就好像剛出生的小朋友，全部都差不多樣子的，很難分辦。不過根據教科書，lymphoblast比myeloblast體積小，且細胞核與細胞質的比例（Nuclear cytoplasmic ratio）較高。Lymphoblast細胞核較深色，不會有很「鬆」的感覺，而且相較起myeloblast，會比較規則，沒有那麼「三尖八角」。而且如果大家記得上回提及的Auer rods（http://drstanford.blogspot.hk/2016/07/32.html），那是AML專屬的，只要見到它，我們就百分之百可以肯定細胞是myeloblast。

雖然myeloblast及lymphoblast很難在顯微鏡下分辦，但幸好我們還有其他方法分辨它們。比較傳統的方法是使用特殊的染料，如myeloperoxidase及Sudan black B染料會染上AML的細胞，而PAS染料會染上ALL的細胞。

但近來一種叫流式細胞技術（Flow cytometry）的新科技又為我們病理學家帶來了新的希望。這種技術把螢光化合物黏在血液細胞上，再用雷射照它們，細胞上的螢光化合物就會被激發並發射出頻率低於激發光的螢光。透過分析螢光，我們就有可以知道細胞上的化學物質。這些化學標記，就如細胞的指紋。有了它們，我們就可以更快更準確地認到細胞的真正身份。

母細胞都帶有CD34及TdT，我們可以透過這兩個記號去讓機器替我們找出血液中的母細胞。而myeloblast帶有anti-MPO、CD13、CD33及CD117，B-lymphoblast帶有CD19、cCD22、CD10、T-lymphoblast帶有CD2、cCD3、CD7。

那我們這個病人得的到底是甚麼呢？讓我們看看它的Flow cytometry結果。

原來是B-ALL。

現代醫學發展越來越快，血液癌症變得越來越複雜，單靠顯微鏡已經不足夠，我們往往需要flow cytometry、細胞遺傳學（Cytogenetics）甚至是分子遺傳學（Molecular genetics）等技術去幫助我們。但當然，使用顯微鏡這種優美的傳統技術仍然值得多多學習。不少老一輩病理高手的雙眼是比最新最先進的機器更厲害的。

個案2：

先補充一點，這張顯微鏡片比我們平常所見的綠，因為它是用了pH較高（7.2）的狀態下染色的。這樣我們才可以較容易看到我們想看的東西。

看看下面紅色圈圈中的紅血球，看到它們細胞質中的小圓環嗎？它們其實是瘧疾寄生蟲。

瘧疾寄生蟲會感染紅血球，並在顯微鏡下有各種不同的狀態。在討論它們在顯微鏡下的狀態前，先樣我們溫習一下瘧原蟲的生命周期：

1. 蚊子咬人，把sporozoites放到人的血中，進入肝。

2. Sporozoites在肝細胞中吸取營養，繁殖成很多merozoites

3. Merozoites弄破肝細胞，進入血中

4. Merozoites之後可以進入紅血球，我們稱受感染的紅血球為trophozoites，Merozoites也可以再次進入肝細胞中，重複這循環

5. 瘧疾在trophozoites中成長，越變越多。我們稱帶有很多merozoites的紅血球為schizont。它們破裂又再放出merozoites，不斷這循環，做成發燒發冷

6. Merozoites可以變成雄性或雌性gametocytes，被蚊子吸後，再在蚊子身體繁殖成sporozoites，在蚊子口水線，準備蚊子再咬人傳給下一位受害者

7. 有兩個品種的瘧原蟲 (P. ovale及P. vivax)可以在肝臟進入休眠狀態，可能在幾個月，甚至幾年後重新攻擊我們，我們稱這休眠狀態的瘧原蟲為hypnozoite

如果我們懷疑病人有瘧疾，我們會先準備所謂的「厚片」去確認診斷。「厚片」的血液濃度是一般顯微鏡片的接近30倍，而且紅血球都已經破裂開，所以用來找瘧疾原蟲會容易得多。在「厚片」中，紅點就是細胞核，藍色就是細胞質，所以如果我們看到紅點旁有一團藍色，那就是瘧疾原蟲了。就如下圖中被紅色圈圈著的地方。

「厚片」之後，我們會再用「薄片」去分辨瘧疾原蟲的品種。「厚片」把所以細胞都疊成一堆，很難細膩地看到它們微細的特徵，所以不是個分辨原蟲品種的好方法。瘧疾原蟲有5個不同品種，分別是Plasmodium falciparum、Plasmodium vivax、Plasmodium malariae、Plasmodium ovale及Plasmodium knowlesi。

Plasmodium falciparum是5隻之中最常見的，也是最危險的，絕大部分瘧疾的死亡個案都是由它引起。Plasmodium falciparum在顯微鏡下是一個幼小的環，有時候每個紅血球可以有多於一個環。另外，Plasmodium falciparum的gametocytes在顯微鏡下很像香蕉。不過根據經驗豐富的上司所講，這些banana shaped gametocytes其實很少出現，非常難找到。我們這個個案就是由Plasmodium falciparum引起的瘧疾。

Plasmodium vivax是第二常見的品種。被Plasmodium vivax感染的紅血球會漲大到原本的兩部，它的環比Plasmodium falciparum的大和粗。而且schizont及gametocytes這些形態也非常常見。

以下兩幅圖中出現的就是Plasmodium vivax的gametocytes。

以下的幾個圖表可以幫助我們分辨這幾種不同的品種，它們分別取自A. Victor Hoffbrand的《Postgraduate Haematology》及Babara J. Bain的《Blood cells》。

瘧疾是可以致命的危急疾病，醫生一定要盡快作出診斷，才可以為給予病人適當的藥物，並拯救他們的性命。因此就算病理科醫生在晚上甚至深夜接到懷疑瘧疾的個案，也得盡快趕回醫院去處理。

若有一天公開明目張膽的愛

選舉已經落幕，你站起來，看到了我，不知道該說什麼好。跟你拍完合照後，我們默默地走在一起。
「今天晚上的月亮很圓啊。」我說。
「對不起。」你說。
「為什麼要說對不起？」
你自己也無法解釋。
「因為我說過CY太完美嗎？」我替你解釋。
你垂頭不語。
「你不知道我只不過是想你呷醋，想你緊張我，才會這樣說嗎？」
「不，你還說過你進去後，我們見到你都會即刻縮。」 

「我只不過是想其他『電燈膽』縮，好讓我倆有機會獨處」我紅了眼睛。
「世上最遙遠的距離，不是生與死的距離，不是天各一方，而是我就站在你面前，你卻不知道我愛你。」我哀哀地說。 

你怔怔地望著我，無法說話。 

這是我頭一次對你說我愛你，也是最後一次。
雖然捨不得，我還是在眼淚湧出來之前離開。 

雖然你又像C君，又像小肥，還要反CY，即使這樣，我還是，很喜歡你。如果你從侯主席中收到我這張個人照片，就請你放在床頭，日夜對住，因為那時候我會知道，原來我喜歡的那個男孩，正在看我的照片，Aqui te amo。